Abstrakt
Existuje len málo štúdií včelstiev, kde je kontrola roztočov varroa dosiahnutá integráciou bezplodových podmienok, a to buď úplným odstránením plodu alebo umiestnením matky do klietky, v kombinácii s aplikáciami kyseliny šťaveľovej. Pozorovali sme významnú mortalitu varroa po úplnom odstránení plodu alebo umiestnení matiek do klietky a aplikáciách kyseliny šťavelove vo včelstvách bez plodov, rovnako ako vo včelstvách s plodom, ktorá dostala štyri po sebe idúce aplikácie kyseliny šťavelovej. V laboratórnych testoch sme zaznamenali vyššiu mortalitu včiel v klietke vystavených Apistanu® v porovnaní s kyselinou šťaveľovou alebo neliečenými kontrolnými včelami. Nepredpokladá sa však, že táto úmrtnosť by mala negatívny vplyv na kolóniu. Odporúčame preto kombinovať aplikácie kyseliny šťavelovej s umelými stavmi bezplodových včelstiev dosiahnutými buď odstránením plodov alebo umiestnením matky do klietky ako účinnú stratégiu liečby roztočov varroa.
Úvod
Udržiavanie zdravých kolónií včiel medonosných (Apis mellifera L.) závisí od kontroly parazitického roztoča Varroa destructor Anderson a Truemann (varroa). Zatiaľčo neošetrené kolónie skolabujú v priebehu niekoľkých rokov, používanie akaricídov vo včelárstve by sa malo minimalizovať, aby sa zabránilo hromadeniu chemických zvyškov a ich vedľajších produktov v mede a vosku (Wallner 1999) a aby sa znížil potenciálny vývoj rezistencie voči akaricídom (Ruijter 1994 ). Existuje len málo dát, ktoré by odrádzali od používania „prírodných akaricídov“, ako sú organické kyseliny (Milani 1999), ktoré sa nehromadia vo vosku a majú toxikologicky nevýznamné hromadenie zvyškov v mede (Imdorf et al. 1996). Prírodné, netoxické organické kyseliny vrátane kyseliny šťaveľovej (Liebig 1998; Al Toufailia et al. 2015) boli úspešne testované ako miticídy a včelári ich používajú čoraz častejšie (Coffey a Breen 2016; Charrière a Imdorf 2002).
Používanie rôznych roztokov kyseliny šťavelovej na kontrolu varroa (varroacídov) sa zvyšuje kvôli ich vysokej účinnosti a nízkemu riziku kontaminácie úľa a často sa aplikuje na kolónie nakvapkaním roztoku kyseliny šťavelovej a cukrovej vody medzi rámiky úľov (Charrière a Imdorf 2002). Charrière a Imdorf (2002) tiež zhodnotili, že kyselina šťavelová je účinná v kolóniách bez plodu, pretože kyselina šťavelová ovplyvňuje iba foretické roztoče prítomné na dospelých včelách. Účinnosť kvapkania kyseliny šťavelovej vo včelstve je obmedzená na cca. 5 dní; preto je potrebné aplikáciu kyseliny šťavelovej opakovať (Gregorc a Planinc 2004). Odporúčaná aplikačná dávka na úľ je 50 ml roztoku kyseliny šťavelovej s hláseniami o niekoľkých koncentráciách dihydrátu kyseliny šťavelovej + cukrovej vody, vrátane 3,4 % kyseliny šťavelovej + 47,6 % sacharózy, 3,7 % kyseliny šťavelovej + 27,1 % sacharózy a 3,0 % kyseliny šťavelovej + 32,0 % sacharózy (obe látky sú uvádzané v pomere hmotnosť/hmotnosť, w/w) (Nanetti 1999; Gregorc a Smodiš Škerl 2007; Charrière a Imdorf 2002). Vyššie koncentrácie kyseliny šťavelovej zmiešané v cukrovej vode budú vykazovať väčšiu účinnosť proti varroa ako roztoky s nižšími koncentráciami, s podobnou reakciou na toxicitu vyjadrenou u včiel medonosných (Charrière a Imdorf 2002). V jednej štúdii prežili včely medonosné vystavené odporúčanej dávke 100 μg kyseliny šťavelovej na dospelú včelu dlhšie ako 72 hodín a mortalita sa nelíšila od neliečenej kontroly (Aliano et al. 2006). Predpokladá sa teda, že dávkovanie dihydrátu kyseliny šťavelovej v roztoku s cukrovou vodou má vplyv na mieru úmrtnosti roztočov aj včiel (Milani 2001; Charrière et al. 2004; Al Toufailia et al. 2015). Kyselina šťaveľová je prirodzenou zložkou medu s rozsiahlym výskumom jej akaracidnej účinnosti samostatne aj v kombinácii s rôznymi biotechnickými metódami kontroly varroa (Giacomelli et al. 2016; Gregorc et al. 2016). Tieto biotechnické metódy môžu zahŕňať odstránenie trúdového plodu (Delaplane et al. 2005) alebo umiestnenie matky do klietky, pričom v oboch prípadoch sa vytvorí obdobie umelého prerušenia plodu (Rosenkranz et al. 2010; Giacomelli et al. 2016). Umiestnenie matky do klietky v kombinácii s aplikáciami akaricídu môže zvýšiť účinnosť kontroly varroa na > 96 % (Nanetti et al. 2012; Pietropaoli et al. 2012; Giacomelli et al. 2016). Dočasné umiestnenie matky do klietky môže byť tiež kombinované s odstránením zaviečkovaného alebo nezaviečkovaného plodu, čo viedlo k > 93 % účinnosti kontroly (Calis et al. 1999). Zatiaľ čo kyselina šťavelová je vysoko účinný miticíd (Nanetti 1999), pri viac koncentrovaných roztokoch (>1 % kyseliny šťavelovej) existujú dôkazy o určitom oslabení kolónií (Charrière 2001; Toomemaa et al. 2010). Preto sa domnievame, že kyselina šťavelová je vhodná na kontrolu varroa, pokiaľ sa používa odporúčaná dávka na základe miestnych klimatických a včelárskych podmienok.
Prvým cieľom tejto štúdie bolo určiť komparatívnu toxicitu troch rôznych roztokov dihydrátu kyseliny šťavelovej v cukrovej vode, ktorá sa používa ako varroacíd, na dospelých robotniciach v klietkach v laboratórnych podmienkach. Druhým cieľom bolo určiť účinnosť postupných aplikácií 2,9% kyseliny šťavelovej / 31,95% roztoku cukru vo vode v kombinácii s umelým prerušením plodu buď (1) umiestnením matky do klietky, (2) úplným odstránením plodu alebo (3) bez prerušenia plodu, ale s tromi po sebe nasledujúcimi aplikáciami kyseliny šťavelovej. Výsledky týchto experimentov podporia väčšiu informovanosť o možnostiach, ktoré majú včelári na účinnú kontrolu varroa.
Materiály a metódy
Uskutočnil sa laboratórny experiment, aby sa stanovila komparatívna toxicita troch roztokov kyseliny šťaveľovej a tau-fluvalinátu (Apistan®) na dospelých včelách robotniciach získaných z kolónií včiel medonosných. Vybraný roztok kyseliny šťavelovej z laboratórneho testu sa potom použil v terénnom pokuse v kombinácii buď s úplným odstránením plodu alebo umiestnením matky do klietky, aby sa otestovala účinnosť na kontrolu varroa v kolóniách včiel medonosných.
Laboratórny experiment
Včely robotnice z troch kolónií boli očistené od ich plástov, zmiešané a umiestnené v 473 ml jednorazových plastových pohároch (spodný priemer 8 cm a výška 13,5 cm; položka č. 416, Fineline, Middletown, NY). Poháre (Evans et al. 2009) boli upravené cca. osemdesiatimi 3 mm prevzdušňovacími otvormi vyvŕtanými v bokoch, ako aj jedným 12 mm otvorom vyvŕtaným v hornej časti (na pridanie vody) a po stranách (na odstránenie mŕtvych včiel alebo pridanie potravy v prípade potreby). Včelám v každej skupine klietok bola poskytnutá voda a potrava (Pro Winter Patty, Mann Lake Ltd., Hackensack, MN), ad libitum. Vytvorilo sa päť oddelených liečebných skupín so šiestimi klietkami po 20 včiel na každé ošetrenie. Ošetrenia boli nasledovné: (1) 40 μl roztoku 3,4 % kyseliny šťavelovej (CAS č. 6153-56-6; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 47,6 % sacharózy (10 g kyseliny šťavelovej dihydrátu, 100 g sacharózy 100 g vody); (2) 40 ul roztoku 3,7 % kyseliny šťavelovej a 27,1 % sacharózy (7,6 g kyseliny šťavelovej-dehydrátu, 38 g sacharózy a 100 g vody); (3) 40 ul roztoku 3,0 % kyseliny šťavelovej a 32,0 % sacharózy (6,5 g kyseliny šťavelovej-dehydrátu, 50 g sacharózy a 100 g vody) roztoku; (4) 1 x 1 cm kus Apistan® (Vita, Basingstoke, Spojené kráľovstvo) pripevnený k špendlíku, ktorý zabezpečuje vystavenie včelám z oboch strán; a (5) bola neošetrená kontrola, ktorá dostávala rovnaké množstvá 32 % roztoku cukru. Objem roztoku kyseliny šťavelovej aplikovaného na dospelých jedincov v klietkach sa vypočítal podľa počtu včiel na klietku extrapoláciou údajov z opakovane ošetrovaných kolónií, ktoré dostávali 5 ml roztoku kyseliny šťavelovej na obsadený priestor medzi rámikmi (Gregorc et al. 2016).
Roztoky kyseliny šťavelovej boli aplikované trikrát: na začiatku experimentu a znova na 4. a 8. deň. Obdobie hodnotenia toxicity pre včely v klietke bolo celkovo 13 dní, aby sa porovnala úmrtnosť dospelých včiel po vystavení viacnásobným aplikáciám kyseliny šťavelovej resp. nepretržitej expozícii voči liečivu Apistan®. Pri prvých dvoch aplikáciách kyseliny šťavelovej dostali všetky klietky v prvej, druhej a tretej liečebnej skupine 40 μl svojho príslušného roztoku kyseliny šťavelovej a pri tretej aplikácii kyseliny šťavelovej určitá časť včiel uhynula. Dostali 20 μl každého roztoku. Kontrolná skupina dostala rovnaké objemy cukrového roztoku. Kontrolné a kyseliny šťavelovej roztoky boli dodávané pipetou cez 12 mm bočný otvor testovacej misky; objem 40 μl sa aplikoval s ôsmimi až deviatimi malými kvapkami, zatiaľ čo objem 20 μl sa rozdelil na štyri až päť kvapiek. To malo napodobniť topickú kyseliny šťavelovej liečbu kolónií umiestnených v teréne, čím sa zabezpečil priamy kontakt so včelami. Klietky sa udržiavali v tmavej miestnosti udržiavanej pri 28 (±1) °C a 65 % relatívnej vlhkosti a mŕtve včely sa počítali a odstraňovali každých 24 hodín.
Terénny experiment
Použili sme 22 kolónií včiel na testovanie kontroly varroa v teréne, a to buď po umiestnení matiek do klietky, úplnom odstránení plodu alebo opakovanom ošetrení kyselinou šťavelovou. Všetky kolónie boli založené na včelárskej stanici na podjednotke McNeill na Mississippi State University v McNeill, MS (30° 39′ 46″ severnej šírky, 89° 38′ 01″ západnej šírky) s použitím kráľovien odchovaných v Taliansku. Experimentálne kolónie boli správne a plne vyvinuté a boli umiestnené v 10-rámových Langstrothových hlbokých boxoch (Dadant & Sons, Inc., IL) s plastovými hrebeňovými základmi. Pred experimentom boli kolónie vyrovnané tak, aby zaberali šesť až osem plodových plástov. Spodné dosky z vlnitého plastu (Dadant & Sons, Inc., Hamilton, IL) boli vložené na zaznamenávanie úmrtnosti roztočov, pričom nad dosky boli inštalované drôtené sitá, aby sa zabránilo kontaktu včiel s odpadom. Úle boli umiestnené na drevených paletách a počas experimentu sme nepozorovali, ako mravce odstraňovali roztoče varroa zo spodných dosiek. V termínoch odberu vzoriek sa zaznamenali počty mŕtvych roztočov a vyčistili sa spodné dosky. Úrovne prirodzeného „poklesu“ roztočov boli zaznamenané štyrikrát pred aplikáciou ošetrenia (od 22. marca do 22. apríla) a 11-krát po aplikácii (od 22. apríla do 14. júla; obrázok 2). Všetky kolónie boli riadené rovnakým spôsobom až do 22. apríla, kedy boli kolónie náhodne rozdelené do troch experimentálnych skupín: odstránenie plodu, umiestnenie kráľovnej do klietky alebo kolónie ošetrené kyselinou šťavelovou.
Na celkový experiment odstraňovania plodu sa použilo sedem kolónií skupiny 1. Po otvorení úľa boli včely zmetené zo všetkých otvorených alebo zaviečkovaných plástov späť do ich pôvodných úľových boxov s pridaním základov plástov a so všetkými matkami identifikovanými a ponechanými vo svojich kolóniách. Potom sa z včelína odstránili plodové plásty a dospelé včely v kolóniách teraz bez plodov sa ošetrili kvapkaním kyselinou šťavelovou. V siedmich kolóniách skupiny 2 boli matky v klietkach na 25 dní a po dosiahnutí bezplodových podmienok sa 17. mája uskutočnilo kvapkanie kyselinou šťavelovou. Naše nové klietky pre matky boli vyrobené z 19 mm preglejky s rozmermi 9 × 15 cm. Do preglejky boli vyvŕtané dva otvory (priemer 84 mm) a zakryté 3,1 mm kovovým sitom na oboch stranách, aby sa matka udržala v klietke s objemom klietky 194 cm3. Ďalší otvor (priemer 10 mm) bol vyvŕtaný do okraja klietky na vloženie a uvoľnenie matky na konci experimentu (obrázok 1). Všetky kolónie zo skupiny 2 sa skúmali každých 7 až 10 dní, pričom sa odstránili všetky novovybudované materské bunky. Nakoniec bolo osem kolónií ošetrených kyselinou šťavelovou zo skupiny 3 ošetrených kyselinou šťavelovou štyrikrát, aby sa zmeral účinok manipulácie s plodom na kontrolu varroa. 17. mája boli všetky experimentálne kolónie súčasne ošetrené roztokmi kyseliny šťavelovej. Mŕtve varroa na doskách dna sa normálne počítali 3 a 7 dní po každej aplikácii kyseliny šťavelovej.
Každá kolónia ošetrená kyselinou šťavelovou dostala 5 ml 2,9 % kyseliny šťavelovej a 31,9 % roztoku sacharózy vo vode (w/w) na obsadený priestor medzi plástami. Ošetrenia boli pripravené s použitím dihydrátu kyseliny šťaveľovej (Sigma-Aldrich), sacharózy (cukor) a demineralizovanej vody (Gregorc a Planinc 2001) a boli nakvapkané cez hrebene in situ pomocou injekčnej striekačky. Na stanovenie relatívnej úrovne zamorenia (počet roztočov/včela) v experimentálnych kolóniách sa dospelé včely odobrali na testovanie cukrovým trepaním (Gregorc et al. 2016) pred a po ošetrení 22. apríla a 25. mája. Vonkajšia teplota a vlhkosť počas cukrových trepaní boli 22. apríla T = 21 °C a RV = 70 % a 25. mája T = 27 °C a RV = 72 %. Teploty pri aplikáciách kyseliny šťavelovej sa pohybovali od 19 °C 22. apríla do 23 °C 17. mája. Po poslednom ošetrení kyselinou šťavelovou 17. mája a cukrovom trepaní 25. mája sa do každej experimentálnej kolónie umiestnili dva prúžky liečiva Apistan®, aby sa zistili akékoľvek pozostávajúce roztoče Varroa (obrázok 2).
Štatistická analýza
Štatistická analýza a generovanie obrázkov boli vykonané v prostredí R (R Core Team 2011). Premenné tejto štúdie zahŕňali (1) mortalitu včiel, (2) počet varroa, (3) odstránenie plodu a (4) umiestnenie matky do klietky. Všetky premenné boli najprv testované na normalitu pomocou Shapiro-Wilkovho testu a neboli normálne rozdelené. Pokúsili sme sa normalizovať naše údaje log-transformáciou a zopakovali sme Shapiro-Wilkov test s grafmi Q-Q, aby sme vizualizovali distribúciu dát. Aj keď logaritmická transformácia zlyhala pri normalizácii nášho súboru dát, dáta podľa dátumu boli blízko normálu a analýza rozptylu (ANOVA) sa uskutočnila na úrovni spoľahlivosti 95 %. ANOVA nie je veľmi citlivá na mierne odchýlky od normality (Glass a kol. 1972; Harwell a kol. 1992; Lix a kol. 1996) a významné výsledky boli dvakrát kontrolované neparametrickými testami. Analýzy hlavných komponentov (PCA) sa uskutočnili pomocou balíka „Devtools“ a „FactoMine“ na výpočet percenta variability vyjadrenej v trojrozmernom priestore a na štúdium zhlukov a skupín na základe ich celkovej podobnosti. Ani hodnoty s najvyššou odchýlkou neboli vynechané zo súborov dát a ako s takými sa s nimi zaobchádzalo, aby sa spravodlivo vyhodnotili experimentálne premenné.
Výsledky
Laboratórny experiment
Merania úmrtnosti včiel v klietke z troch ošetrení kyselinou šťavelovou sa uskutočnili v priebehu 13-dňového laboratórneho experimentu a znova 4 dni po poslednom ošetrení kyselinou šťavelovou. Tieto boli porovnané s mortalitou v skupine liečenej liečivom Apistan® a kontrolnej skupine. Čas pozorovania 13 dní zahŕňal úmrtnosť včiel v klietke medzi ošetreniami kyselinou šťavelovou a 4 dni po poslednom ošetrení kyselinou šťavelovou, ako aj úmrtnosť vyvolanú prúžkami liečivá Apistan® a kontrolným ošetrením. Žiadna z koncentrácií kyseliny šťavelovej sa významne nelíšila v úmrtnosti včiel (obrázok 2) a skupina liečená Apistan® bola jediná, ktorá vykazovala významne vyššiu úmrtnosť včiel v porovnaní s tou kontrolnou (F = 2,7, n = 390, df = 4; P = 0,02) (obrázok 3).
Terénny experiment
22 experimentálnych kolónií nevykazovalo žiadne významné rozdiely v prirodzenej mortalite na varroa pred aplikáciou liečby (22. marca až 22. apríla), či už v porovnaní medzi úľmi alebo budúcimi experimentálnymi skupinami (F = 2,9, n = 198, df = 2, P = 0,06) ( Obrázok 4). PCA individuálne a variabilné mapové faktory odhalili slabú variabilitu (27 a 19 %) vyjadrenú na oboch osiach 1 a 2 (obrázok 4). Na druhej strane, v dôsledku projekcie premenných na prvých dvoch osiach (1 a 2) nie je možné vidieť žiadne zhlukovanie úľov z akejkoľvek formy. Výsledky po liečbe ukázali významné rozdiely v mortalite na varroa medzi našimi tromi liečebnými skupinami (odstránenie plodov, umiestnenie matky do klietky, opakované ošetrenie kyselinou šťavelovou) v rôznych časoch (obrázok 5). Ošetrenie kyselinou šťavelovou aplikované 22. apríla na odstránenie plodu a kolónie ošetrené kyselinou šťavelovou vykazovalo významný účinok na mortalitu varroa v porovnaní s neošetrenými kolóniami s matkami v klietke (po ošetrení 1; P < 0,001) (obrázok 5). Účinky kyseliny šťavelovej pretrvávali až do druhého počtu varroa (po liečbe 2), čo ukazuje kontinuálny významný účinok na mortalitu varroa (P < 0,001). Avšak pri druhom ošetrení kyselinou šťavelovou pre kolónie ošetrené kyselinou šťavelovou opakovane sa úmrtnosť roztočov v porovnaní s predchádzajúcim ošetrením znížila, ale stále bola významná (P < 0,05). Tretia aplikácia kyselinou šťavelovou na kolónie ošetrené kyselinou šťavelovou (po ošetrení 5) nemala žiadny účinok na zníženie zamorenia varroa v porovnaní s ďalšími dvoma skupinami. 17. mája, keď boli všetky kolónie simultánne ošetrené kyselinou šťavelovou, iba kolónie kráľovnej v klietke vykazovali významne vyššiu mortalitu varroa (P < 0,01) v porovnaní s kolóniami z ďalších dvoch liečebných skupín (obrázok 5). Konečné ošetrenie liečivom Apistan naznačilo, že spomedzi troch ošetrovaných skupín iba kolónie s odstráneným potomstvom mali významne (P < 0,05) vyššiu mortalitu varroa. Počas experimentu nebola pozorovaná žiadna úmrtnosť matiek v klietke a všetky matky boli prepustené a pokračovali v znášaní vajíčok.
Dynamika úmrtnosti varroa v kolóniách na základe troch rôznych metód liečby použitých v našej štúdii je pozoruhodne odlišná. Celková mortalita roztočov po liečbe sa medzi skupinami nelíšila (obrázok 6). Vzor úmrtnosti na varroa sa však jasne líšil a PCA rozlišovala dve hlavné skupiny (odstránenie plodov a umiestnenie matky do klietky + liečba kyselinou šťavelovou). Podobne neboli zaznamenané žiadne celkové rozdiely v záťaži varroa medzi týmito tromi skupinami medzi 22. aprílom a 17. májom.
Diagnostické testy cukrových trepaní sa vykonali v období pred liečbou (22. apríla) aj po liečbe (25. mája) (obrázok 7). Pomocou počtu č. roztočov na 100 včiel ako výpočet percenta napadnutia, relatívne úrovne napadnutia varroa dospelých včiel boli odhadnuté na 3,22 % (± 2,51 %) pred ošetrením a 0,25 % (± 0,51 %) po ošetrení, čo predstavuje štatisticky významné zníženie (P < 0,001 ) pri zamorení varroa z každej liečenej skupiny (obrázok 7). Boli tiež významné rozdiely v redukcii roztočov medzi liečenými skupinami (P < 0,001). Cukrové trepania po ošetrení ukázali, že v experimentálnych kolóniách bolo zabitých v priemere 86,02 % (± 26,69 %) roztočov – dáta nie sú zobrazené.
Upozornenie: Nedokončené znenie prekladu.
Autori zdrojového textu: Aleš Gregorc, Mohamed Alburaki, Chris Werle, Patricia R. Knight & John Adamczyk
Zdroj: https://link.springer.com/article/10.1007/s13592-017-0526-2